조직뿐만 아니라 약물에 대한 반응성 실험을 수행 할 경우에도 time-series 라이브러리를 제작하고 여러 샘플을 한 번에 시퀀싱 할 수 있는 Multiplex Identifiers(MIDs)를 이용하여 단 시간에 많은 데이터로 이 같은 분석을 진행할 수 있다. Roche 454의 경우 192에서 최대 2300 개의 샘플을 한 번에 로딩하여 시퀀싱이 가능할 정도로 유연성이 있으므로 다양한 조건을 대상으로 분석에 활용할 수 있는 이점이 있다[9].

발현 패턴 분석으로는 gene trees, experiment trees, self-organizing maps, K-means clustering, QT clustering, 그리고 PCA 분석이 가능한 것으로 알려져 있다. 이 모든 기능은 데스크탑 컴퓨터에서 분석이 가능하며, 사용자 편의성이 강조된 인터페이스로 구성되어 있어, 비전문가도 쉽게 분석을 수행할 수 있다.

2-2-3. Tissue Specific Gene Analysis

 조직 특이 유전자는 특정 조직에서 그 유전자의 세포내 평균 발현 양 보다 특이적으로 높게 발현 되어 특정 조직의 성격을 결정지을 수 있는 유전자를 선별하는 것을 목적으로 한다.
따라서 NGS reads를 이용하여 분석하고자 할 때에는 조직별 라이브러리 제작 시 아무런
영향을 주지 않은 정상적인 발현 상태의 라이브러리를 제작해야하며, normalization이나 subtraction과 같은 인위적인 선출 방식의 시퀀싱이 아닌 무작위적인 방식의 시퀀싱이 진행되어야만 한다. 무작위 적으로 일어나는 사건에 대한 확률 값을 계산하므로 포아송 분포(poisson distribution)를 이용한 Audic’s test를 통해 조직 특이 유전자를 선별한다[8]. 다음은 Audic’s test를 이용한 확률 값을 구하는 수식이다.

  이 때, 다양한 cutoff 파라미터를 통해 확률적으로 유의한 유전자를 선별하는데, p_value, enrichment, frequency 그리고 클러스터내의 minimum reads count 등을 이용 할 수 있다. 이중 p_value는 유의 수준을 나타내는 것으로 0.001의 cutoff는 유의 수준 99.9%를 의미하게 된다. 그러나 조직 특이 유전자 선별을 위해 한 두 개의 유전자를 대상으로 연관성 분석이 진행 되는 것이 아니라 앞서 언급된 파라미터를 통과한 모든 클러스터를 대상으로 연관성 분석이 진행하므로 검사의 개수가 증가할수록 임의로 발생하는 오류 또한 증가하여 p_value의 의미가 감소하는 문제점이 발생하게 된다. 이를 극복하기 위해 Bonferroni correction, False Discovery Rate(FDR), 그리고 Permutation test와 같은 다중 검정을 수행하게 된다[6, 7].

실제 분석을 위해 앞서 작성한 Cluster Member Matrix(CMM; DEP작성시 초기 matrix)를 이용하여 각 클러스터별로 x, y, N1, N2을 지정하여 계산할 수 있다[16]. 예를 들어 그림 3의 표에서 클러스터 1의 유전자가 ‘OC’ 조직에 특이적인 발현 양을 보이는지를 검사 한다고 했을 때 대상 조직의 reads 개수인 y 는 ‘10’이 되고 그 외 나머지 조직에 해당하는 reads 개수인 x 는 ‘82’가 된다. 그리고 N2, N1 은 각각 해당 조직 전체 reads 개수와 나머지 조직의 전체 reads 개수인 ‘55,840’과 ‘184,301’에 해당한다. 이러한 분석은 하나의 클러스터마다 검사해야할 조직 개수만큼 수행된다.


이번주에 이어서 다음 주에 진행될 연재에서도 Expression study의 다양한 분석 방법에 대해 연재가 될 예정입니다. 많은 관심 부탁드립니다.