Sequencher는 DNA 서열 데이터를 빠르게 분석하여 결과를 제공하는 소프트웨어입니다. 특히, sanger sequencing 데이터로부터 assembly 후 variation 정보를 찾아주는데 포커싱 되어 있어 특정 영역의 SNP 분석에 굉장히 유용하게 평가되고 있습니다. 최근 5버전대로 업그레이드가 되면서 NGS 데이터까지 분석이 가능하도록 기능이 확장되었고, 커맨드라인으로만 분석 가능했던 퍼블릭 툴들을 초보자들도 사용하기 쉽도록 GUI를 제공하여 편의성을 더해주었습니다.

그럼 NGS 데이터를 이용하여 실제적으로 어떤 분석이 가능한지 살펴볼까요?


Next-Gen Sequencing
[Reference assembly]
Sequencher에서는 NGS 데이터를 이용하여 reference assembly 시 이용하는 3개의 큰 알고리즘(Maq, GSNAP, BWA-MEM)이 있습니다. Maq이나 GSNAP을 통해 assemgbly 분석을 진행하면 SNP 분석도 함께 가능하며, 그 결과 값은 Tablet이나 Maqview를 이용하여 확인할 수 있습니다. 커맨드라인으로 제공하던 BWA-MEM도 GUI를 통해 다양한 옵션값을 손쉽게 설정할 수 있습니다. GSNAP이나 BWA-MEM로부터 얻은 VCF 포맷의 variant 정보는 SAMtools를 이용하여 분석할 수 있습니다.

[De novo assembly]
Reference 정보가 없는 de novo assembly의 경우에는 Velvet 알고리즘을 지원하고 있습니다. Velvet 또한 GUI를 제공함으로써, Tablet으로 결과값을 확인할 수 있고, 다양한 옵션값을 쉽게 설정할 수 있습니다.




[RNA-seq]
최신버전에서는 Differential Gene Expression(차등유전자발현) 연구를 위해 가장 많이 이용되는 RNA-seq 툴 중 하나인 Cufflinks를 플러그인으로 사용할 수 있습니다. Cufflinks 는 SAM 파일로부터 align된 reads를 가지고 GTF annotation 파일을 이용해 다시 align 하며, 다른 isoform과 transcript를 찾아줍니다. 이후 Cuffmerge를 통해 Cufflinks에서 나온 두 개의 transcript 파일을 하나의 transcript consensus 파일로 만들어 줍니다. 이 파일은 차등유전자발현 분석을 하는 Cuffdiff에 사용됩니다. Sequencher는 Cuffdiff에서 나오는 최종파일들(volcano plot, scatter plot, bar chart)을 다루며 발현 레벨에서 차이점을 그래픽으로 보여줍니다.







Connections
[BLAST & primer-BLAST]
Sequencher Connections는 Sequencher의 통합 웹 확장 툴이며, 이를 이용하여 2개 이상의 분석들을 동시에 진행할 수 있습니다. 다중 BLAST를 진행할 수 있어, 각 서열의 분석 결과를 실시간으로 빠르게 얻을 수 있습니다. 같은 서열로 다른 파라미터 조건을 주어 BLAST가 가능하며, 동시에 Local BLAST 까지도 수행할 수 있습니다. 또한 primer design을 위한 primer-BLAST를 할 수 있고, 해당 서열의 특정 영역을 확인 후 Sequencher Project에 예측된 primer를 저장할 수 있습니다. BLAST 검색 결과를 Web view 탭을 통해 뷰어할 수 있고, 이는 36시간 내에 다시 불러올 수 있으며, 그 이후로는 접근이 어렵습니다.



[MUSCLE alignment]
만일 여러 개의 서열로 그룹 분석을 하고 있다면, 다중서열정렬 알고리즘 중 가장 빠른 MUSCLE을 가지고 alignment를 할 수 있습니다. Sequencher Connections에서는 MUSCLE alignment를 다양한 옵션값으로 할 수 있고, alignment 이 후 phylogenetic tree도 생성할 수 있어 서열간의 유연관계도 확인할 수 있습니다.



이렇게 Sequencher에서는 NGS 분석까지 가능하도록 툴들이 확장되고 있습니다. 특히나 커맨드라인의 툴들을 사용하기 어려운 일반 생물학자들도 쉬운 인터페이스를 가진 Sequencher를 이용하여 NGS assembly를 진행할 수 있습니다. 그럼 Sequencher를 통해 NGS의 다양한 분석을 진행해 보세요.

Posted by 人Co