연재 순서

  1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis
Quipu Issue Paper 기술 소식지 첫 번째 연재로 NGS Assembly 중에 Reference assenbly에 대해 알아보도록 하겟습니다.

1. Next Generation Sequencing?

 1-2. Assembly

 Next Generation Sequencing(NGS)으로 인한 무제한적인 서열 데이터 생산은 이후 생물정보학적 분석의 가장 큰 도전 과제가 되었다. 일차적으로 많은 양의 데이터 관리부터 분석과정 마다의 computing 속도가 문제로 제기 되었다. 그중 가장 첫 번째 단계가assembly이다. NGS 서열의 assembly는 그 목적에 따라 크게 reference assembly와 de novo assembly로 구분 지어진다. Reference assembly의 경우 variation 및 epigenetics 연구에 주로 이용되고 de novo assembly의 경우 기존의 genome project에서 진행하던 whole genome sequencing에 이용되고 있다. 세부적인 내용을 다음에서 알아보자.

  1-2-1. Reference assembly

 Re-sequencing을 통한 기존의 reference 서열과의 비교로 유전체 상의 variation 연구를 목적으로 진행하는 시퀀싱은 주로 single reads를 얻는 시퀀싱 보다는 paired-end 시퀀싱이 수행된다. 그 이유는 다양한 질병 관련 유전자의 SNP 및 CNV 분석을 위해서는 single reads 보다는 paired-end reads가 더 유용하기 때문이며, 이들 데이터는 앞서 언급한 다양한 플랫폼에서 생산되고 있다. 이렇게 생산된 NGS 데이터를 분석할 수 있는 프로그램은 오픈 소스로 제공 되는 것과 그렇지 않은 것들로 여러 개가 존재한다. 그 중 오픈 소스로 제공하는 SOAP[1], MAQ[2] 그리고 ZOOM[3]은 paired-end short read에 최적화 되어 있고, Newbler는 long reads인 454 reads에 최적화 되어 있다. 이렇게 대부분 특정 NGS 플랫폼에서 생산된 데이터만을 다룰 수 있도록 고정화되어 있는 것에 반해 CLC bio사의 CLC NGS Cell[4]은 언급된 모든 플랫폼의 데이터를 분석할 수 있는 장점이 있다[14]. 이들 프로그램에 대하여 좀 더 자세히 알아보자.

 NGS assembly 프로그램을 평가하는데 있어 가장 큰 이슈는 분석 속도와 결과의 정확성, 그리고 그 외 분석의 용이성을 들 수 있다. 이들에 대한 비교 분석을 위해 표 1에서 보여 지는 paired-end의 short reads을 대상으로 여러 가지 분석을 수행하였다. 이러한 분석은 64-bit Xeon E5420 CPUs에 32 GB memory system에서 수행되었다[1].

첫 번째인 분석 속도에서는 CLC NGS Cell이 가장 빠른 것으로 평가 되었다(표 2)[5].
SIMD 기술을 이용한 병렬 데이터 처리로 속도 면에서 월등히 높은 성능을 나타내었다. 그 외 SOAP의 경우 reference 서열을 2-bit로 전환하여 index 파일을 이용한 연산 처리로 좋은 결과를 보이고 있다(2009.11 현재 SOAP의 경우 업그레이드를 통해 분석 속도가 많이 향상 되었다).

  특히, Maq의 경우 Illumina와 SOLiD의 paired-end reads를 대상으로 human 유전체에 맵핑할 경우 CPU time으로 10 시간 동안 백만 개 paired-end reads를 assembly 할 수 있다고 밝혔다[2]. 같은 시험을 위해 자체적으로 SOLiD reads를 대상으로 CLC NGS Cell을 이용하여 분석했을 때 CPU time으로 5시간 28분에 분석이 완료됨을 확인하였다.  두 번째로 NGS read의 alignment 비율 및 정확성을 살펴보았다. 최근 논문 PLoS ONE에 기재된 ‘Mapping Accuracy of Short Reads from Massively Parallel Sequencing and the Implications for Quantitative expression Profiling’에서는 BLAT[15], SSAHA2[16], Bowtie[17], SeqMap[18], MAQ, CLC NGS Cell을 대상으로 다양한 종의 데이터로 프로그램의 정확성을 다각도로 분석한 결과를 발표 하였다[6]. 그 결과 그림 1에서 보여 지는 것과 같이 SSAHA2와 CLC NGS Cell이 높게 평가되었다. 이 중 SSAHA2는 Sanger institute에서 개발된 프로그램으로 현재 SOLiD data를 제외한 모든 플랫폼의 데이터를 분석할 수 있다[7]. 기본적으로 Smith-Waterman alignment를 수행하며 2-bit로 전환하여 정확한 assembly를 수행한다. 그 다음 CLC NGS Cell은 모든 플랫폼의 데이터를 처리함과 동시에 SSAHA2와 같이 안정적으로 reads 길이에 관계없이 정확한 assembly를 수행하고 있다. 또한 특이할만한 점은 yeast, drosophila, arabidopsis 그리고 human을 대상으로 한 다양한 데이터로 short reads와 long reads(>50bp)에 대한 프로그램 성능을 비교 하였음에도 불구하고(MAQ: short read만이 분석 가능), 프로그램별로 일관성 있는 결과를 보여주고 있다는 것이다. 각기 다른 종과 read 길이로 약간의 차이는 보이나 전반적으로 동일한 분석 패턴을 보이고 있어, 이는 곧 데이터의 특성보다는 프로그램별 알고리즘의 차이가 분석 결과에 더 많은 영향을 미치는 것으로 해석된다. 따라서 NGS를 이용한 분석에서 다양한 프로그램을 이용하여 분석 파이프라인을 구축하는 것 보다는 사전에 충분한 테스트를 통해 동일한 알고리즘으로 구성된 프로그램을 이용하는 것이 결과의 안정성과 정확성을 높일 수 있는 하나의 방법이 될 수 있겠다.      

NGS를 이용한 연구에서 특히 re-sequencing을 하는 경우 대부분 유전체 상의 variation 연구를 목적으로 진행된다. 따라서 re-sequencing된 데이터는 기존의 reference 서열과는 다른 variation을 가지는 특성이 있으므로 이를 고려한 assembly 알고리즘이 필요하다.



마지막으로 분석의 용이성을 여러 가지 측면으로 살펴보았다. NGS 분석을 목적으로 개발된 MAQ, SOAP, 그리고 CLC NGS Cell은 모두 웹에서 다운로드가 가능하다. 이 중 CLC NGS Cell은 압축만 해제하면 바로 실행할 수 있는 바이너리 파일을 제공하고 있고, SOAP과 MAQ은 각각 압축 해제 후 compile을 통해 쉽게 설치가 가능하다.

이 후 분석에 필요한 입력 데이터 형식은 CLC NGS Cell이 가장 호환성이 좋아 FASTA, FASTQ, csfasta(SOLiD), Scarf, Sff의 모든 형식의 파일을 입력 받을 수 있었으며 SOAP과 MAQ은 각각 프로그램에 맞는 형식이 따로 존재하여, 이들 형식으로 전환할 수 있는 프로그램을 따로 제공하고 있는 실정이다. 이때 paired-end reads의 경우 분석 결과의 신뢰성과 정확성을 높이기 위해 assembly 수행 전에 서열이 쌍으로 존재하는지 여부를 체크하게 되는데, 이를 점검할 수 있는 프로그램을 CLC NGS Cell과 MAQ은 제공하고 있다. 이는 분석자에게 NGS reads의 전처리 과정을 수월하게 진행할 수 있게 하는 편의성도 고려된 것이다.

Reference 서열 또한 CLC NGS Cell은 FASTA 형식과 genbank 형식의 파일을 바로 입력 받을 수 있는 장점을 가지고 있으며, 나머지 프로그램은 각각의 형식으로 전환할 프로그램을 제공하여 한 번의 분석 단계를 더 수행하도록 되어있다. 그 외 분석에 필요한 옵션사항은 약간의 차이를 보일뿐 큰 차이는 없었으나, 다음 분석을 위한 assembly 결과 파일의 데이터 호환성에서는 CLC NGS Cell과 MAQ이 SOAP보다는 우위를 나타내었다. 마지막으로 NGS 분석 프로그램에서 중요하게 체크해야 할 사항 중에 하나는 assembly 과정을 나눠 진행하고 이후에 결과를 하나로 합쳐 볼 수 있는 기능이 있는지를 살펴보는 것이다.

제한된 computing power로 이처럼 큰 사이즈의 유전체 서열과 NGS reads를 분석해야 하므로 한 번에 데이터를 분석 한다는 것은 매우 어려운 일이다. 따라서 가능한 분산 처리로 데이터를 나눠 분석하고 이들을 통합할 수 있는 기능이 있어야만 한다. 다행히 이러한 기능은 CLC NGS Cell(join_assemblies)과 MAQ(mapmerge)에서 제공을 하고 있었다. 이들 각각의 특징은 표 3에서 자세히 확인할 수 있다.


다음 연재에서는 Reference assembly에 이어서 NGS Assembly 중에 de novo assembly에 대해 알아보도록 하겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

 1. Li R, Li Y, Kristiansen K, Wang J. (2008) SOAP: short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 24, 713–714 (http://soap.genomics.org.cn/index.html)
 2. Li H, Ruan J, Durbin R. (2008) Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res 18, 1851–1858 (http://maq.sourceforge.net/index.shtml)
 3. Lin H, Zhang Z, Zhang MQ, Ma B, Li M. (2008) ZOOM! Zillions of oligos mapped. Bioinformatics 24, 2431–2437 (http://www.bioinfor.com)
 4. CLC NGS Cell : http://www.clcbio.com
 5. White paper on reference assembly on the CLC NGS Cell 2.0 (www.clcbio.com)
 6. Palmieri N, Schlötterer C. (2009) Mapping accuracy of short reads from massively parallel sequencing and the implications for quantitative expression profiling. PLoS One. 28, 4(7):e6323.
 7. Ning Z, Cox AJ, Mullikin JC. (2001) SSAHA: a fast search method for large DNA databases. Genome Res. 10, 1725-1729.
 8. Roche 454 : http://www.454.com/
 9. Zerbino DR, Birney E. (2008) Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res 18, 821–829.(http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/)
 10. Newbler : 454 bundle program
 11. Birol I, Jackman SD, Nielsen CB, Qian JQ, Varhol R, Stazyk G, Morin RD, Zhao Y, Hirst M, Schein JE, Horsman DE, Connors JM, Gascoyne RD, Marra MA, Jones SJ. (2009) De novo transcriptome assembly with ABySS. Bioinformatics. 21, 2872-2877
 12. White paper on de novo assembly in CLC NGS Cell 3.0 beta (www.clcbio.com)
 13. Andreas T., Eva T., Thomas B., Alexander G., Ulrike L. and Alfred P. Ultrafast de novo sequencing of the human pathogen Corynebacterium urealyticum with the Genome Sequencer System (http://www.454.com/downloads/protocols/Whole_Genome_Sequencing_And_Assembly.pdf)
 14. Horner DS, Pavesi G, Castrignanò T, De Meo PD, Liuni S, Sammeth M, Picardi E, Pesole G. (2009) Bioinformatics approaches for genomics and post genomics applications of next-generation sequencing. Brief Bioinform. [Epub ahead of print]
 15. Kent WJ. (2002) BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 4, 656-664.
 16. Ning Z, Cox AJ, Mullikin JC. (2001) SSAHA: a fast search method for large DNA databases. Genome Res. 10, 1725-1729.
 17. Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzburg SL. (2009) Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 3, R25
 18. Jiang H, Wong WH. (2008) SeqMap: mapping massive amount of oligonucleotides to the genome. Bioinformatics. 20, 395-396.

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안녕하십니까?

생물정보 컨설팅 전문기업 (주)인실리코젠입니다.
저희 (주)인실리코젠 Codes팀은 최신 생물정보학관련 연구 동향에 대한 기술 소식지(Quipu Issue Paper)를 발간하고 있습니다. Frederick Sanger에 의해서 시퀀싱 기술이 개발된 이후 오랜 기간 동안 많은 종의 유전정보가 밝혀져 왔습니다. Human Genome Project가 완성되었으며, 아직도 수많은 동물, 식물, 미생물에 대한 시퀀싱이 전 세계에 걸쳐 진행되고 있습니다. 최근에는 생산성을 획기적으로 개선한 Next Generation Sequencing (NGS) 기술이 개발되어 기존에 비해 시간과 비용을 비약적으로 줄일 수 있게 되었습니다. NGS 기술은 단순히 시퀀싱의 방법만을 바꿔놓은 것이 아니라 유전체 연구의 새로운 토대를 만들어가고 있습니다. 하지만 아직도 NGS 기술이 기존의 분석 방법에서 어떠한 변화를 가져오는 것인지, 어떠한 분석 전략이 필요한 것인지 궁금해하는 연구자분들도 많은 것이라 생각됩니다. 'NGS 시대의 분석 전략 2'라는 제목으로 발간된 Quipu Issue Paper 2호에서는 앞서 말씀드린 NGS에 대한 기본적인 이해를 도울 수 있도록 다양한 변화를 습득하고 하고 계시는 연구에 조금이나마 도움이 되기를 바랍니다. 앞으로도 생물정보 분야에서 끊임없이 노력하는 기업이 되겠습니다.

기술 소식지 연재는 블로그를 통해 2월 8일부터 시작되어 약 9주에 걸쳐 진행될 예정입니다. 연재 순서는 아래와 같습니다.

많은 관심 부탁드립니다.
감사합니다.

연재 순서

1. Assembly
2. Variation study
3. Expression study
4. Epigenomics
5. Genome Annotation
6. Next Generation Bioinformatics
7. Data Management for web 2.0 Era
8. Semantic Network for Integrated Biology Data
9. Gene Network Discovery by Text-mining
10. Centralization for High-throughput Data Analysis

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지난 2일 국립수의과학검역원 동물위생연구동의 세미나실에서 올해 시범사업인 ‘바이러스 유전자 변이감시 프로그램’의 설명회가 있었습니다.

바이러스 유전자 변이감시 프로그램은 이미 e축산뉴스, 디지털타임즈, 축산경제신문 등의 언론보도가 있었고, 돼지인플루엔자 바이러스(SI)의 유전자 변이 및 신종 바이러스 유입 등의 정보를 체계적으로 감시하여 사전에 예측할 수 있는 유전자 분석 체계로서 지난 7월부터 경기 등 4개 시,도 방역기관에 시범적으로 시작되었습니다.

이번 설명회는 당사에서 구축한 시스템을 시연하는 자리로서 국립수의과학검역원 바이러스과, 4개 시,도 축산위생연구소, (주)마크로젠에서 모두 참석해주셨고, 강병철 박사님께서 시스템의 전반적인 설명과 실제 예제를 이용한 데이터 입력 방법, 분석 진행과정, 분석 결과 내용 등에 대한 발표를 진행하셨습니다.

또한 질의 및 답변 시간은 추가적으로 필요한 사항과 앞으로 개선되어야 할 점 등에 대한 토론으로 시스템이 한층 더 발전할 수 있는 계기가 될 수 있는 중요한 시간이었습니다.

그 리고 인플루엔자 서열 분석에 사용되어질 CLC Main Workbench 프로그램에 대한 기본적인 기능 및 간단한 시연을 할 수 있는 시간도 마련되었으며, 다른 기관에서도 기본적인 생물정보 분석을 진행해볼 수 있도록 프로그램 설치방법과 라이센스를 제공하였습니다.

아직 시작에 불과하지만 본격적인 분석 파이프라인이 구축되어지고, 더욱 더 전문적인 생물정보 분석을 통하여 현재 유행되고 있는 신종 인플루엔자 바이러스 또한 체계적으로 감시하고 정확하게 예측할 수 있길 기대합니다.

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ARIADNE GENOMICS사의 Pathway 분석 제품인 PathwayStudio의 사용자 교육이 8월 31일(월) 오전 11시부터 당사 회의실에서 있었습니다. 이번 사용자 교육은 한국생명공학연구원과 중앙대학교에서 몇몇 연구원분들이 참석한 가운데 저희 회사 생물정보실의 박준형 팀장님께서 진행을 해주셨습니다. 저희 회사의 소개로 발표가 시작되었고, 약 3시간에 걸쳐서 진행된 교육은 직접 시연을 통해 PathwayStudio 사용법을 자세하게 살펴보는 시간이었습니다.

시연의 내용으로는 PathwayStudio의 인터페이스 소개에서부터 기본 사용법과 유용한 기능들에 대해 알아보고 기능들을 활용해서 단백질, Small molecules, Cell processes 등 다양한 Entity 사이에 어떠한 관계를 가지고 있는지 Pathway를 직접 그리면서 시연해 주셨고, 최근에 이슈가 되고 있는 텍스트마이닝 기법을 이용한 MedScan을 활용하여 NCBI PubMed의 문헌정보 뿐만 아니라 자신이 가지고 있는 PDF, TXT 파일에서 자동으로 생물학적 상호작용에 대한 정보를 추출하는 방법에 대해서도 배워보았습니다. 특히 연구자의 마이크로어레이데이터와 실험데이터를 이용하여 pathway를 재구성 하는 내용은 참가자들로부터 많은 관심을 받았습니다.

사용자 교육을 하고 계신 박준형 팀장님과 교육에 참여하고 있는 참석자분들


사용자 교육 중간에는 다함께 점심을 먹으며 저희 회사 이야기와 참여하신 분들의 연구실 이야기 등 화기애애한 이야기를 주고받는 시간을 갖기도 했습니다. 점심시간 이후에도 교육이 계속 진행되었고, 교육에 참여하신 분들이 그 동안 PathwayStudio를 사용하면서 궁금하셨던 점에 대해 질문하시고 박준형 팀장님께서 질문에 대해 직접 시연으로 답변을 해주셨습니다. 이번 사용자 교육은 일방적인 Presentation 발표와는 달리 직접 PathwayStudio 사용 방법에 대해 시연을 함으로써 양방향 커뮤니케이션이 가능하여 사용자 입장에서 좀 더 유익한 시간이 되었을 것이라고 생각합니다. 앞으로도 사용자와 소통할 수 있는 교육의 자리가 많이 만들어졌으면 합니다. 마지막으로 사용자 교육을 마치고 저희 회사 이미지월 앞에서 그날 참석하신 분들과 함께 찍은 기념사진을 담아보았습니다.

사용자 교육에 참여한 모든 분들과 기념사진

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이번 달 초에 둘 째 아이를 임신중인 아내의 혈액검사에서 다운증후군 위험율이 높다는 진단이 나왔다. 확진을 위해서 양수를 샘플링해서 태아의 핵형검사 결과를 했고 지난 19일에 그 결과를 확인하러 갔다. 검사 결과를 기다리는 10여일간 아내는 꽤 걱정스러워했고, 난 아래의 역설을 들며 걱정말라고 위로했다. 하지만, 솔직히 불안한 마음 어쩔 수 없었다. 지식과 마음에는 분명한 간극이 존재한다...

진단 시험법의 역설은 정확도가 높은 진단 검사법도 실제의 정확도를 다시 볼 필요가 있다는 점을 보여준다. 아래의 예를 보자.

만약 '암'을 검사하는 매우 좋은 진단법이 있다고 가정하자. 암환자가 검사를 받으면 99%의 확률로 양성 반응을 보이며 암이 없는 환자가 검사를 받으면 99%로 음성 반응보인다. 즉, 1%의 오류율을 보이는 매우 정확한 방법이다. 여기서, 다시 인구 1만명당 1명이 암을 가진다고 가정할 때, 어떤 사람이 검사를 받았고, 결과가 양성으로 나왔다. 이런 경우에 그 사람이 진짜 암환자일 확률은?

정말 좋은 검사법으로 보여진다! 하지만 실제 임의의 사람이 위 검사법으로 검사하고 양성으로 나올 때 실제 암이 걸렸을 확률은 단지 1% 조금 못된다. (참고: [베이즈 정리])


여기서,

• P(C | +)는 우리가 얻고자하는, 검사결과가 양성일 때 암일 확률이고,

• P(+ | C)는 암환자의 양성율로 이 예제에서는 99%, 즉, 0.99이며,

• P(C)는 사전확률이라는 용어로 표현되며 집단중에서 실제 암환자의 비율로 본 예제에서는 1 / 10000 이다.

• P(N) = 1 - P(C), 집단중에서 정상인의 비율

• P( + | N)은 위양성율(false positive)로 본 예제에서는 1%이다.

실제 계산을 해 보면 P(C | +)는 0.0098로 위의 검사법을 임의의 사람에게 검사하고 양성이 나왔을 경우, 실제 암일 확률은 1%도 안되는 것이다.

In [1]: PosCancer = 0.99
         # P(C|+)
In [2]: AllCancer = 1.0 / 10000
         # P(C)
In [3]: AllNormal = 1 - AllCancer
         # P(N)
In [4]: PosNormal = 0.01
         # P(+|N)
In [5]: CancerPos = ( PosCancer * AllCancer ) / ( PosCancer * AllCancer + PosNormal * AllNormal)
In [6]: print CancerPos     # P(C|+)
0.00980392156863

사실 병원에서는 다운증후군 혈핵검사를 할 때 80%의 정확도가 있다고 설명한다(60% 정확도 검사는 의료보험이 되지만, 80%는 되지 않는다). 그리고, 여기서 양성이 나오면 거의 대부분의 산모는 70 ~ 80 만원의 비용을 내고 핵형검사를 할 수 밖에 없다.

불안과 공포를 과학으로 포장해서 팔면 장사가 잘된다.

-- 강병철 (생물정보실)

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