1. Assembly
   2. Variation study
  3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 유전자 예측 프로그램과 단백질 서열을 유전체에 매핑하여 얻어진 Gene Model을 결합하는 유전체 모델의 결합(Gene model merging)에 대해 알아보겠습니다.

B-3. 유전체 모델의 결합(Gene model merging)

 앞서 설명한 유전자 예측 프로그램을 통해서 얻어진 Predicted Gene Model(PGM)과 mRNA, EST, 단백질 서열을 유전체에 매핑하여 얻어진 Evidenced Gene Model(EGM)을 합쳐 Consensus Gene Model(CGM)을 만든다. 각 유전자 모델마다 가중치를 다르게 설정하여 동일한 위치에서 중복적으로 지지를 받아 높은 score 합계를 갖는 유전자 모델이 CGM으로 채택이 된다[3].

 일반적으로 EGM이 PGM 보다 높은 가중치를 가지며 EGM 가운데에서도 full-length mRNA > protein> mRNA > EST 순으로 우선 순위를 배정한다. PGM도 evaluation을 통해 프로그램별 우선순위를 정해주기도 한다. CGM을 만드는 과정은 full-length mRNA를 가장 우선 순위로 채택하되, full-length mRNA가 없을 경우 단백질과 EST, PGM이 제공하는 정보를 통해 complete CGM을 형성한다(그림 5).



 몇 가지 예시를 통해 대표 되는 유전자 모델 형성 과정을 알아보도록 하자.
첫 번째 full-length mRNA를 통해 얻어진 EGM이 partial 단백질과 ESTs에 의해 공통적으로 exon/intron 정보를 제공 받아 complete CGM을 형성하였다(그림 6의 case1). 다음은 mRNA EGM이 없고 단백질 EGM이 가장 높은 가중치를 갖는 유전자 모델이 되어 EST 가 제공하는 3’ 정보를 통해 complete CGM을 형성한 경우 이다. 이때 EST EGM은 단백질 EGM의 partial 형태로 동일한 exon/intron 구조를 보이고 있다. 세 번째는 mRNA, 단백질 모두 존재하지 않고 partial ESTs EGM 만 존재할 때 EST EGM 하나 하나는 모두 낮은 가중치이나 동일한 위치에서 동일한 exon/intron 구조로 여러 ESTs EGM이 지지하고 있으므로 CGM을 형성할 수 있다. 또한 일정부분 동일한 유전자 구조를 갖는 PGM으로부터 3’ 정보를 제공 받아 complete CGM을 형성하였다. 마지막 네 번째 경우 세 번째 경우와 동일하게 PGM과 EST EGM이 존재하는 가운데 두 gene model이 서로 상이한 exon/intron구조를 보이고 있어 어떠한 CGM도 만들 수 없는 상황을 보여주고 있다. 만약 PGM 만이 존재할 경우라도 여러 프로그램을 통해 얻어진 PGM이 모두 동일한 exon/intron 구조를 갖는다면 CGM을 형성 할 수 있다. 대부분의 genome annotation에서 evidence 데이터를 충분히 갖추고 진행되기란 쉽지 않다. 따라서 종종 Evidenced Gene Model(EGM) 없이 Predicted Gene Model(PGM) 만으로 Consensus Gene Model(CGM)을 만드는 경우가 존재한다.

이러한 유전자 모델을 형성하는 프로그램으로는 Tigr에서 공개 소스로 제공하는 EVModeler[9]가 있다. Perl 스크립트로 구성된 프로그램은 GFF3 포맷의 gene model 정보를 입력받아 정해진 gene model별 가중치를 토대로 Consensus Gene Model을 제시한다.
 

C. Alternative splicing analysis

다양한 유전자 모델을 통해 Consensus Gene Model을 형성하고 나면 이후 alternative splicing 분석을 위해 transcripts를 분석한다[12]. mRNA, ESTs, 단백질, NGS reads 서열이 제공하는 다양한 transcripts를 consensus gene model (CGM)에 비교하여 alternative transcript model을 제시 한다. 이후 조직 특이적인 alternative transcripts나 cancer specific alternative transcripts 분석으로 biological meaning에 초점을 두고 분석을 진행하게 된다[3].

그림 7. Alternative splicing 분석

다음 연재에서는 유전자의 기능을 분석하는 방법 중에 먼저 상동성 기반의 Annotation에  대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.

참고문헌

 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
 967–974.
 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.

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연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번주부터 2주간 진행되는 연재에서는 Next Generation Sequencing의 두 번째 Application인 Expression study에 대해 알아보도록 하겠습니다.

2-2. Expression Study

 

 Functional genomics의 유전자 발현 연구 분야에도 NGS는 예외 없이 새로운 방향을 제시하면서 transcriptome 분야를 포함하여 많은 부분에서 PCR이나 마이크로어레이 기술을 대체 하고 있다. 이러한 NGS 기술은 분석 할 종의 서열 정보가 없어도 분석 가능하여 어떤 생물종도 연구에 이용할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라 한 번의 시퀀싱으로 수많은 read를 얻는 높은 coverage를 가지기 때문에 단 시간에 적은 비용으로 전체 염기서열을 결정할 수 있는 이점이 있다. 이러한 장점들은 마이크로어레이를 이용한 종전의 분석법에서 나타난 여러 문제점을 보완하면서 다양한 방향으로 연구를 수행할 수 있게 하였다. Development stage, stress, tissue와 같이 특정 컨디션에서의 유전자 발현 양상을 보는 것에서부터 조직 특이 유전자 분석, house keeping 유전자 분석, 유전자 발현을 이용한 ortholog 분석, SNP 분석 그리고 alternative splicing 분석에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 분석이 가능하게 되었다[1].

발현 분석은 언제, 어디서, 어느 정도로 유전자들이 발현되는 지를 전사 수준에서 총체적으로 탐색 하는 것을 목적으로 한다. 따라서 원하는 컨디션이 반영된 mRNA를 추출하여 라이브러리를 제작하게 되고, 무작위 적으로 시퀀싱 하여 얻어진 서열을 클러스터링을 통해 발현 양을 추정하게 된다[2, 4, 5, 17, 18, 19].




 이러한 방법은 기존의 ESTs를 활용한 발현 분석과 동일한 방법으로, 클러스터링 방법 또한 EST 클러스터링과 같이 유전체 서열이 존재하는 경우 references assembly을 수행하여 유전자 영역을 기준으로 클러스터링을 수행하게 되고, 만약 유전체 서열이 존재하지 않을 경우 de novo assembly을 수행 하게 된다. 단 de novo assembly의 경우 assembly의 정확성을 위해 short reads 보다는 Roche 454의 long reads를 이용하는 것이 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다(1-2. Assembly 참조)[17, 18, 19].

 클러스터링이 완료되면 각 클러스터 별로 포함되어 있는 NGS reads의 개수를 발현 수치 값으로 환산하여 Digital Expression Profile(DEP)를 작성하게 되며 이는 마치 마이크로어레이의 intensity를 이용한 분석법과 같이 분석하게 된다[17, 18]. 이때, 실험적인 바이어스와 생물학적 컨디션을 고려한 다양한 통계적 방법이 이용된다.


다음 연재에서는 Expression study 중에 먼저 여러 조직에서 다양한 발형 양을 보이는 유전자의 경우 각 조직마다의 발현양을 계산하는 방법인 Digital Expression Profile(DEP) 작성하는 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다.

많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

1. Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B. (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 7, 621-628.
2. Fei Z, Tang X, Alba RM, White JA, Ronning CM, Martin GB, Tanksley SD, Giovannoni JJ. (2004) Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening. Plant J. 40, 47–59
3. Rensink WA, Lee Y, Liu J, Iobst S, Ouyang S, Buell CR. (2005) Comparative analyses of six solanaceous transcriptomes reveal a high degree of sequence conservation and species-specific transcripts. BMC Genomics. 6, 124
4. Ronning,C.M. et al. (2003) Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiol. 131, 419–429
5. Guo J, Zhu P, Wu C, Yu L, Zhao S, Gu X. (2003) In silico analysis indicates a similar gene expression pattern between human brain and testis. Cytogenet Genome Res. 103, 58-62
6. Benjamini, Y., Daniel Yekutieli. (2001) The control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing under dependency. Annal. Stat. 4(29), 1165–1188
7. Tsai CA, Hsueh HM, Chen JJ. (2003) Estimation of false discovery rates in multiple testing: application to gene microarray data. Biometrics. 59, 1071-81
8. Audic S, Claverie JM. (1997) The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 7, 986–995
9. Roche 454 : Products & Solutions - Multiplexing
(http://www.454.com/products-solutions/experimental-design-options/multiplexing.asp)
10. Tatusov RL, Koonin EV, Lipman DJ. (1997) A genomic perspective on protein families. Science. 278, 631-637
11. Kato T, Murata Y, Miura K, Asai K, Horton PB, Koji T, Fujibuchi W. (2006) Network-based de-noising improves prediction from microarray data, BMC Bioinformatics. 7, S4
12. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 5, 229-243
13. Zeeberg BR, Feng W, Wang G, Wang MD, Fojo AT, Sunshine M, Narasimhan S, Kane DW, Reinhold WC, Lababidi S, Bussey KJ, Riss J, Barrett JC, Weinstein JN. (2003) GoMiner: a resource for biological interpretation of genomic and proteomic data, Genome Biol. 4, R28
14. GeneSpring GX : Products & Services - GeneSpring GX Software
(http://www.chem.agilent.com/en-US/products/software/lifesciencesinformatics/genespringgx/pages/default.aspx)
15. Wingender E, Chen X, Hehl R, Karas H, Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Prüss M, Reuter I, Schacherer F. (2000) TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation. Nucleic Acids Research. 28, 316-319
16. PathwayStudio : Products-pathway Studio
(http://www.ariadnegenomics.com/products/pathwaystudio/)
17. Eveland AL, McCarty DR, Koch KE. (2007) Transcript profiling by 3'-untranslated region sequencing resolves expression of gene families. Plant Physiol. 146, 32-44.
18. Torres TT, Metta M, Ottenwälder B, Schlötterer C. (2008) Gene expression profiling by massively parallel sequencing. Genome Res. 1, 172-7.
19. Vega-Arreguín JC, Ibarra-Laclette E, Jiménez-Moraila B, Martínez O, Vielle-Calzada JP, Herrera-Estrella L, Herrera-Estrella A. (2009) Deep sampling of the Palomero maize transcriptome by a high throughput strategy of pyrosequencing. BMC Genomics. 10, 299.
20. Wang ET, Sandberg R, Luo S, Khrebtukova I, Zhang L, Mayr C, Kingsmore SF, Schroth GP, Burge CB. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 2456, 70-76.
21. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, Kan Z, Loerch PM, Armour CD, Santos R, Schadt EE, Stoughton R, Shoemaker DD. (2003) Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science. 302, 2141-2144.
22. Ledford H. (2008) Human genes are multitaskers. Nature. 456, 9.
23. CLC Genomics Workbench: RNA-Seq analysis
(http://www.clcbio.com/index.php?id=1330&manual=RNA_Seq_analysis.html)

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